Fibryle kwasu moczowego: nowy wymiar patogenezy dny moczanowej

Czy kwas moczowy tworzy struktury amyloidopodobne?

Kwas moczowy (UA) od wieków kojarzony jest z dną moczanową – schorzeniem, które dotyka 1-2% populacji zachodniej i manifestuje się bolesnym zapaleniem stawów. Mimo że UA jest produktem rozpadu puryn i jego rola w krystalizacji w stawach jest dobrze znana, mechanizmy molekularne prowadzące do agregacji UA pozostają słabo poznane. Dotychczas zakładano, że UA bezpośrednio krystalizuje, powodując objawy dny. Nowe badania sugerują jednak, że proces ten może być bardziej złożony i obejmować etap tworzenia struktur fibrylarnych, podobnych do amyloidów białkowych.

Odkrycie, że metabolity – takie jak cysteina, szczawian czy adenina – mogą tworzyć struktury amyloidopodobne, zrewolucjonizowało nasze rozumienie wrodzonych błędów metabolizmu. Badania wykazały, że te małe cząsteczki, podobnie jak białka amyloidowe, mogą samoorganizować się w fibryle o charakterystycznej morfologii, zdolności wiązania barwników oraz cytotoksyczności. W przypadku cystyny i szczawianu fibryle pojawiają się przed kryształami, co sugeruje, że proces fibrylizacji może być kluczowym etapem w krystalizacji metabolitów.

W kontekście UA szczególnie interesujące jest pytanie, czy tworzenie fibryli może być odpowiedzialne za inicjację krystalizacji i wybór polimorfów krystalicznych. Ponadto, mechanizm działania allopurynolu – inhibitora oksydazy ksantynowej i leku pierwszego rzutu w leczeniu dny – nie został dotychczas przeanalizowany pod kątem jego wpływu na agregację UA na poziomie molekularnym. Niniejsze badanie, wykorzystując zaawansowane techniki spektrometrii mas z mobilnością jonów (IMS-MS), mikroskopię elektronową (TEM) oraz krystalografię rentgenowską, miało na celu wyjaśnienie, jak UA agreguje się w fibryle i kryształy oraz jak allopurynol i inhibitor amyloidowy EGCG modulują te procesy.

Jakie metody wykorzystano do badania agregacji UA?

Badania przeprowadzono z użyciem kilku komplementarnych technik. Spektrometria mas z mobilnością jonów (IMS-MS) pozwoliła na bezpośrednią detekcję oligomerów UA w fazie gazowej – od dimerów do 60-merów. Próbki UA przygotowano w stężeniach 500 µM do 1 mM w octanie amonu (pH 7), co odpowiada 8-17 µM polipeptydu o 60 resztach aminokwasowych, czyli zakresowi typowemu dla badań amyloidów białkowych. Analiza IMS-MS umożliwiła pomiar przekrojów czynnych (CCS) klastrów UA, co dostarczyło informacji o ich wielkości, kształcie i ładunku.

Mikroskopia elektronowa transmisyjna (TEM) oraz mikroskopia optyczna zostały zastosowane do wizualizacji struktur fibrylarnych i krystalicznych UA. Próbki UA inkubowano w buforze PBS w stężeniach od 0,5 do 2,0 mg/ml, stopniowo chłodząc roztwory w celu umożliwienia samoorganizacji. Dla oceny wpływu inhibitorów, UA mieszano z allopurynolem (150 µM) lub EGCG (1 mM), a następnie analizowano morfologię powstałych struktur.

Krystalografia rentgenowska pojedynczych kryształów oraz dyfrakcja rentgenowska proszków (PXRD) pozwoliły na identyfikację polimorfów krystalicznych UA – bezkrystalicznych (UAA) oraz dihydratowych (UAD). Pomiary wykonano na dyfraktometrze Bruker D8 Discover z lampą miedzianą (40 kV, 40 mA) w zakresie kątów 15-40° 2θ. Testy cytotoksyczności przeprowadzono na komórkach HEK293 z użyciem testu MTT, oceniając żywotność komórek po 24-godzinnej ekspozycji na UA w różnych stężeniach (0,5-2,0 mg/ml).

Jak kwas moczowy agreguje się w fibryle i kryształy?

Analiza IMS-MS wykazała, że UA tworzy oligomery o różnych rozmiarach, od małych klastrów (n<10) do uporządkowanych struktur (n>10). Dla małych klastrów obserwowano szerokie rozkłady czasów dryfu (ATD), co sugeruje ich niestabilność i tendencję do dysocjacji w fazie gazowej. Natomiast większe klastry (n>10) charakteryzowały się dobrze rozdzielonymi pikami w ATD, co wskazuje na ich większą stabilność strukturalną. Wartości przekrojów czynnych (CCS) rosły liniowo wraz z wielkością klastra, co potwierdza uporządkowany wzrost agregatów.

Mikroskopia TEM ujawniła, że UA w stężeniach 0,5-1,5 mg/ml tworzy głównie struktury fibrylarne o średniej szerokości 12,36 ± 2,21 nm (mediana 12,08 nm, zakres 7,0-19,1 nm, n=190). Rozkład szerokości fibryli był w przybliżeniu symetryczny z niewielką skośnością prawostronną (skewness=0,36). Te wartości są zbliżone do klasycznych fibryli amyloidowych białkowych, które mają szerokość 10-20 nm. W wyższych stężeniach (2,0 mg/ml) dominowały duże kryształy, co sugeruje, że fibrylizacja jest procesem kinetycznie preferowanym przy niższych stężeniach, podczas gdy krystalizacja stanowi produkt termodynamicznie stabilny przy wyższym przesyceniu.

Dyfrakcja rentgenowska proszków (PXRD) potwierdziła, że UA krystalizuje w formie bezkrystalicznej (UAA) z parametrami komórki elementarnej: a=6,192 Å, b=7,407 Å, c=13,081 Å, β=90,436°. Struktura krystaliczna składa się z dwóch warstw łańcuchów UA, stabilizowanych przez wiązania wodorowe N-H···O i oddziaływania π-π. Orientacja łańcuchów wzdłuż płaszczyzn (210) i (21̄0) tworzy kąt około 60° względem osi c, co tłumaczy acikularną morfologię kryształów i skłonność do tworzenia fibryli.

Czy fibryle UA są cytotoksyczne dla komórek?

Testy cytotoksyczności na komórkach HEK293 wykazały, że zarówno fibryle, jak i kryształy UA wywierają szkodliwy wpływ na żywotność komórek. Komórki HEK293 wybrano jako model ze względu na kluczową rolę nerek w patogenezie dny moczanowej – schorzenie to jest dobrze udokumentowaną przyczyną niewydolności nerek. Ekspozycja na UA w stężeniach 0,5-2,0 mg/ml (2,97-11,9 mM) prowadziła do zależnego od dawki spadku żywotności komórek, ocenianej testem MTT.

Aby rozdzielić efekty fibryli i kryształów, próbki UA w stężeniu 1,0 mg/ml poddano wirówkowaniu (5000 × g, 1 min), co pozwoliło na separację supernatantu zawierającego głównie fibryle od osadu z kryształami. Zarówno frakcja fibrylarna (supernatant), jak i kryształowa (osad) obniżały żywotność komórek w porównaniu do kontroli (medium bez UA), chociaż efekt był silniejszy dla próbek niefrakcjonowanych zawierających oba typy agregatów (p<0,01 dla próbek niefrakcjonowanych, p<0,05 dla frakcji fibrylarnej i krystalicznej).

Analiza czasowa wykazała, że inkubacja UA w medium hodowlanym przez 24-72 godziny w temperaturze pokojowej prowadzi do stopniowego wzrostu liczby i rozmiaru kryształów. Mikroskopia optyczna potwierdziła obecność kryształów już po 24 godzinach, a ich obfitość znacząco wzrastała w ciągu kolejnych dni. Te wyniki sugerują, że cytotoksyczność UA wynika zarówno z działania fibryli, jak i kryształów, przy czym fibryle mogą reprezentować wczesny, potencjalnie odwracalny etap agregacji, który z czasem przekształca się w bardziej trwałe struktury krystaliczne.

Jak allopurynol modyfikuje agregację kwasu moczowego?

Allopurynol, lek pierwszego rzutu w leczeniu dny moczanowej, działa jako inhibitor oksydazy ksantynowej (XOD), zapobiegając konwersji hipoksantyny do ksantyny i ksantyny do UA. Jednak jego wpływ na już istniejące agregaty UA pozostawał nieznany. Badania IMS-MS mieszaniny ekwimolarnej UA i allopurynolu nie wykazały obecności heterokompleksów UA-allopurynol w spektrach masowych, co sugeruje, że allopurynol nie tworzy stabilnych kompleksów z małymi klastrami UA.

Kluczowym odkryciem było pojawienie się nowych cech w rozkładach czasów dryfu (ATD) dla klastrów UA w obecności allopurynolu. W czystej UA oligomery o stosunku n/z (wielkość klastra do ładunku) wykazywały charakterystyczne czasy dryfu rosnące wraz z wielkością klastra. W obecności allopurynolu pojawiły się dodatkowe cechy przy dłuższych czasach dryfu, które odpowiadały dużym klastrom UA (około 29-36 jednostek) o ładunku z=1. Co istotne, czasy dryfu tych nowych cech pozostawały stałe przy wzroście nominalnego n/z od 3/1 do 11/1, co wyklucza możliwość, że pochodzą one z małych oligomerów.

Interpretacja tych danych sugeruje, że allopurynol oddziałuje z dużymi klastrami UA, destabilizując je i prowadząc do ich dysocjacji po wyjściu z komory dryfu (dysocjacja post-IM). Rozkład produktów dysocjacji zależy od wielkości i struktury początkowych heterooligomerów, co wyjaśnia, dlaczego cechy z=1 stają się bardziej intensywne i lepiej rozdzielone wraz ze wzrostem wielkości klastra. Ten efekt można porównać do „ponownego rozpuszczania” dużych klastrów UA przez allopurynol, co może hamować tworzenie fibryli lub dihydratowych kryształów (UAD) i promować formowanie bardziej stabilnych, bezkrystalicznych form (UAA).

Mikroskopia TEM i optyczna potwierdziły te obserwacje. Fibryle UA w obecności allopurynolu były grubsze i bardziej heterogenne niż w czystej UA. Analiza statystyczna trzech niezależnych zestawów danych (n=190 pomiarów dla czystej UA, n=190 dla UA z allopurynolem) wykazała, że średnia szerokość fibryli w obecności allopurynolu wzrosła o 11,61 nm (95% CI: -12,16, -11,06; p<0,001). Test Welcha potwierdził tę różnicę (t=-41,57, p<0,001), a nieparametryczny test Manna-Whitneya (U=736, p<0,001) potwierdził, że rozkłady szerokości fibryli różnią się istotnie. Bootstrapping dał przedział ufności różnicy średnich [-12,17, -11,07] nm, co dodatkowo wspiera wniosek o istotnym wpływie allopurynolu na morfologię fibryli.

Czy allopurynol zmienia polimorfizm kryształów UA?

Krystalografia rentgenowska pojedynczych kryształów ujawniła, że allopurynol ma dramatyczny wpływ na wybór polimorfu krystalicznego UA. Kryształy UA uzyskane z czystych roztworów UA lub UA z EGCG były wyłącznie w formie dihydratowej (UAD), podczas gdy kryształy z mieszaniny UA-allopurynol były wyłącznie w formie bezkrystalicznej (UAA). Ta obserwacja opiera się na analizie rentgenowskiej wielu kryształów z każdej próbki, co potwierdza powtarzalność wyniku.

Forma UAD jest uznawana za metastabilną w warunkach fizjologicznych i przekształca się w UAA, która jest termodynamicznie bardziej stabilna. Grases i współpracownicy wykazali, że transformacja UAD w UAA zachodzi w kontakcie z cieczą i towarzyszy jej tworzenie heksagonalnych, masywnych kryształów UAA oraz pękanie kryształów UAD. Liu i współpracownicy potwierdzili, że kryształy UAA są znacznie twardsze i bardziej kruche niż UAD. Presores i Swift zidentyfikowali rozpuszczanie UAD jako etap limitujący szybkość tej transformacji.

Nasze dane sugerują, że allopurynol przyspiesza transformację z UAD do UAA, prawdopodobnie przez wspomaganie rozpuszczania klastrów UA i omijanie etapu krystalizacji UAD. Co ciekawe, krystalizacja UA w obecności allopurynolu jest znacznie wolniejsza (tygodnie do miesięcy) niż w czystej UA (dni), co wskazuje, że allopurynol nie tylko zmienia szlak krystalizacji, ale także opóźnia sam proces. Możliwe, że allopurynol konkuruje z wodą o wiązania wodorowe z UA oraz uczestniczy w oddziaływaniach π-π, co zapobiega krystalizacji UAD i promuje tworzenie UAA.

Mikroskopia optyczna potwierdziła te zmiany morfologiczne. Kryształy UA w obecności allopurynolu były płaskie i wydłużone, w przeciwieństwie do typowych acikularnych kryształów UAD obserwowanych w czystej UA. Dodatkowo, kryształy allopurynolu i UA krystalizowały niezależnie, co wyklucza możliwość współkrystalizacji i potwierdza, że interakcje UA-allopurynol są zbyt słabe, aby stabilizować heterokompleksy w stanie krystalicznym.

Czy EGCG działa inaczej niż allopurynol?

Epigallocatechina gallan (EGCG) to kanoniczny inhibitor amyloidowy, znany z interakcji z małymi klastrami białkowych amyloidów i zapobiegania ich agregacji. W badaniach nad UA, EGCG wykazał zupełnie inny mechanizm działania niż allopurynol. Analiza IMS-MS mieszaniny UA z EGCG ujawniła spadek intensywności pików odpowiadających klastrom UA już w momencie t=0, a po 6 dniach nie wykryto żadnych małych klastrów UA, mimo że sygnały EGCG również zniknęły. To sugeruje, że EGCG oddziałuje z wczesnymi oligomerami UA, zapobiegając ich nukleacji w stabilne klastry.

Mikroskopia TEM potwierdziła te obserwacje. Próbki UA z EGCG wykazywały obecność krótkich, zbitych fibryli, które znacznie różniły się od regularnych, wydłużonych fibryli obserwowanych w czystej UA. Mikroskopia optyczna wykazała, że EGCG silnie hamuje krystalizację UA – obserwowano mniej kryształów, ale były one szersze i bardziej przezroczyste niż w kontroli. Te wyniki wskazują, że EGCG działa w klasyczny sposób, typowy dla inhibitorów amyloidowych: wiąże się z wczesnymi oligomerami i zapobiega ich agregacji w większe struktury.

W przeciwieństwie do EGCG, allopurynol nie hamuje tworzenia małych klastrów UA, ale raczej modyfikuje ich dalszą agregację, prowadząc do tworzenia grubszych, mniej stabilnych fibryli i przyspieszając transformację do termodynamicznie stabilniejszych kryształów UAA. Te różnice w mechanizmach działania podkreślają siłę IMS-MS jako narzędzia do rozróżniania sposobów interakcji inhibitorów z agregatami metabolitów.

Jaki jest związek między fibrylami a kryształami UA?

Nasze wyniki sugerują, że fibrylizacja i krystalizacja UA nie są procesami wzajemnie wykluczającymi się, ale raczej równoległymi i sprzężonymi szlakami agregacji. Fibryle mogą współistnieć z kryształami, jak obserwowano w naszych próbkach, a ich morfologia może wpływać na późniejszy wzrost kryształów. Krystalizacja może również zachodzić niezależnie w sprzyjających warunkach, zwłaszcza przy wysokim przesyceniu.

Interesująca jest możliwa odwrotna zależność między stabilnością fibryli a stabilnością ostatecznie tworzonych polimorfów krystalicznych. W czystej UA obserwowano względnie jednolite fibryle o szerokości około 10-12 nm, co jest zgodne ze stabilnymi strukturami amyloidopodobnymi, które preferowały tworzenie metastabilnego polimorfu UAD. Natomiast w obecności allopurynolu fibryle były grubsze i bardziej heterogenne, co wskazuje na ich zmniejszoną stabilność; jednak te warunki sprzyjały ostatecznemu tworzeniu termodynamicznie stabilnych kryształów UAA.

Model ten sugeruje, że bardziej stabilne fibryle mogą „zamykać” system w metastabilnych stanach krystalicznych, podczas gdy mniej stabilne fibryle pozostawiają system kinetycznie wolny do reorganizacji w bardziej stabilne polimorfy. Chociaż potrzebne są dalsze badania rozdzielcze w czasie, ten model strukturalny dostarcza ram do zrozumienia, jak stabilność fibryli wpływa na wyniki polimorficzne w krystalizacji UA. Strukturalna transformacja bezpośrednio indukowana przez allopurynol w UAA może mieć istotne implikacje dla właściwości fizykochemicznych i zachowania patologicznego złogów UA u pacjentów z dną.

Jakie wnioski płyną z tego badania dla praktyki klinicznej?

Niniejsze badanie ujawnia nowy wymiar biologii kwasu moczowego: UA może samoorganizować się w cytotoksyczne, amyloidopodobne fibryle, co poszerza nasze rozumienie patogenezy dny moczanowej i kamicy nerkowej. Wykorzystując IMS-MS, bezpośrednio uchwycono oligomery UA od dimerów do 60-merów, odkrywając bogate spektrum pośrednich struktur agregacyjnych. Odkryto, że allopurynol, lek pierwszego rzutu w leczeniu dny, nie tylko wpływa na krystalizację, ale także przekształca krajobraz agregacji molekularnej UA.

Ustalenie, że tworzenie fibryli jest etapem pośrednim w agregacji UA, reagującym na działanie leków, redefiniuje patogenezę dny i rozszerza krajobraz terapeutyczny. IMS-MS okazuje się cennym narzędziem nie tylko do analizy szlaków agregacji, ale także do ujawniania molekularnych mechanizmów działania małocząsteczkowych modulatorów. Te ramy nie tylko rozszerzają nasze zrozumienie patofizjologii UA, ale także otwierają nowe możliwości terapeutyczne do przechwytywania patogennej krystalizacji u jej molekularnego źródła.

Nasze dane podnoszą również możliwość, że stabilność fibryli dyktuje wyniki krystaliczne: stabilne, jednolite fibryle w czystej UA faworyzują mniej stabilny polimorph UAD, podczas gdy mniej stabilne, heterogenne fibryle formowane z allopurynolem ostatecznie prowadzą do bardziej stabilnych kryształów UAA. To odkrycie może mieć istotne implikacje kliniczne, ponieważ różne polimorfy krystaliczne mogą różnić się właściwościami fizykochemicznymi i patogennym potencjałem.

Wyniki te podkreślają potrzebę dalszych badań nad mechanizmami działania leków modyfikujących agregację UA oraz nad rozwojem nowych strategii terapeutycznych, które mogłyby celować w etapy fibrylizacji, zanim dojdzie do nieodwracalnej krystalizacji i uszkodzenia tkanek. Zrozumienie tych procesów na poziomie molekularnym może prowadzić do bardziej efektywnych interwencji u pacjentów z dną moczanową i innymi schorzeniami związanymi z akumulacją UA.