Modulacja receptorów rianodynowych – nowe możliwości terapeutyczne

Czy RyRs mogą być skutecznie modulowane?

Receptory rianodynowe (RyRs) stanowią kluczowe wewnątrzkomórkowe kanały wapniowe uczestniczące w sprzężeniu pobudzenia i skurczu w komórkach mięśniowych oraz w sygnalizacji wapniowej w neuronach i innych typach komórek. Dotychczasowe badania nad RyRs koncentrowały się głównie na mutacjach genetycznych lub modyfikacjach potranslacyjnych, które powodują przeciek kanału i prowadzą do zaburzeń mięśni szkieletowych (RyR1), serca (RyR2) lub układu nerwowego (RyR1, RyR2 i RyR3). W konsekwencji opracowano kilka inhibitorów i stabilizatorów RyRs, które zapobiegają patologicznemu wyciekowi jonów wapnia z siateczki sarkoplazmatycznej. Jednak brakuje leków na choroby związane z downregulacją RyRs (mutacje z utratą funkcji RyRs lub zmniejszona ekspresja/aktywność RyRs). Downregulację RyRs stwierdzono w takich chorobach jak sarkopenia (osłabienie mięśni związane z wiekiem, występujące u ponad 20% osób starszych), niewydolność serca (osłabienie serca związane z wiekiem, występujące u ponad 5% osób starszych), osłabienie mięśni na oddziale intensywnej terapii (występujące u 33% pacjentów OIT), miopatie oraz rzadkie schorzenia dziedziczne, takie jak choroby związane z RyR1 i zespół niedoboru uwalniania Ca²⁺.

Kofeina, pochodna ksantyny występująca w roślinach, od dziesięcioleci była wykorzystywana jako farmakologiczne narzędzie badawcze do aktywacji RyRs, a jej właściwości funkcjonalne i wiążące zostały szczegółowo opisane. Kofeina oddziałuje z RyR1-Trp4716 poprzez wiązanie pi-pi w hydrofobowej kieszeni utworzonej również przez reszty RyR1-Phe3753 i RyR1-Ile4996, jak wykazano za pomocą cryo-EM. Miejsce wiązania jest wysoce konserwatywne wśród izoform (RyR1, RyR2 i RyR3) oraz gatunków, ale jego rola fizjologiczna pozostaje niewyjaśniona. Mechanistycznie kofeina stabilizuje domenę C-końcową (CTD), która odpowiada za przekazywanie sygnału wiązania Ca²⁺ do helisy porowej S6, prowadząc do bramkowania. Od 1951 roku wykazano, że kofeina zwiększa siłę i kurczliwość izolowanych mięśni szkieletowych i komórek mięśniowych in vitro. Jednak milimolowe stężenia potrzebne do uzyskania znaczącego efektu są toksyczne dla spożycia przez ludzi, co czyni kofeinę mało interesującą terapeutycznie. Ksantyna jest fizjologicznym metabolitem katabolizmu puryn, powstającym w wyniku aktywności enzymu oksydazy ksantynowej, która katalizuje reakcję: hipoksantyna → ksantyna → kwas moczowy. Wykazano, że ksantyna wiąże się z tym samym konserwatywnym miejscem w RyR2, oddziałując z resztami RyR2-Trp4645 i RyR2-Ile4926 oraz potencjalnie angażując RyR2-Tyr4944. Ksantyna aktywuje RyR2 w zakresie mikromolarnym, sugerując, że może być endogennym ligandem dla tego konserwatywnego miejsca wiązania.

Jak struktura ujawnia sekrety wiązania ligandów?

Niestety, dokładny atomowy opis sposobu koordynacji kofeiny i ksantyny pozostawał niejasny, ponieważ rozdzielczość osiągnięta przez cryo-EM nie była wystarczająca do określenia struktury tych małych i symetrycznych cząsteczek. Wykazano, że inne pochodne ksantyny aktywują RyRs w podobny sposób jak kofeina, sugerując elastyczne miejsce wiązania. W szczególności podstawniki w pozycjach 1, 3 i 7 rusztowania ksantyny okazały się bardziej aktywujące, podczas gdy podstawniki w pozycjach 8 i 9 okazały się mniej aktywujące w porównaniu z ksantyną. Jednak minimalny motyw wiązania, niezbędny do projektowania pochodnych o wysokiej specyficzności i powinowactwie do RyRs, nie został opisany.

Wykorzystując cryo-EM, zbadano liczne pochodne ksantyny i związki pokrewne, identyfikując 4-oksopirymidynę/2-piridon jako minimalny motyw niezbędny do wiązania w miejscu ksantyny/kofeiny w RyRs. Podczas gdy aromatyczność jest niezbędna do wiązania pi z resztą Trp (RyR1-Trp4716 lub RyR2-Trp4645), wodór N-H uczestniczy w wiązaniu wodorowym z resztą Tyr (RyR1-Tyr5014 lub RyR2-Tyr4944). Chociaż interakcja z resztą Tyr nie jest konieczna do aktywacji RyRs, dodatkowe wiązanie wodorowe zwiększa siłę wiązania, umożliwiając aktywację kanału przez stężenia ksantyny, które są fizjologicznie istotne. Allopurinol i oksypurinol, zawierające motyw 4-oksopirymidyny, wiążą się z miejscem ksantyny/kofeiny. Wiązanie allopurinolu/oksypurinolu do RyRs może wyjaśniać niektóre obserwowane korzystne efekty mięśniowe i być wykorzystane w leczeniu chorób związanych z RyR.

Aby określić sposób koordynacji ksantyny i związków pokrewnych, najpierw ponownie przetworzono najlepszy dostępny zestaw danych RyR2 w obecności ksantyny. Używając ulepszonej strategii lokalnego udoskonalania skupionej na miejscu wiązania ksantyny/kofeiny, osiągnięto lokalną rozdzielczość 2,38 Å. Ten poziom rozdzielczości pozwolił na pewne umiejscowienie cząsteczki ksantyny i trzech cząsteczek wody otoczki hydratacyjnej. Zaobserwowano, że ksantyna znajduje się pomiędzy aromatycznym RyR2-Trp4645 (wiązanie pi) i hydrofobowym RyR2-Ile4926, tworząc wiązanie wodorowe z RyR2-Tyr4944 (przez imid N1-H) i oddziałując z karbonylem szkieletu RyR2-Glu4194 poprzez mostek wodny (przez karbonyl C6=O). Ponownie przetworzono również najlepszy dostępny zestaw danych RyR1 w obecności kofeiny, co doprowadziło do lokalnej rozdzielczości 2,12 Å. Ta rozdzielczość pozwoliła na pewne modelowanie orientacji i pozycji cząsteczki kofeiny w miejscu wiązania, co było niejasne w poprzednim modelu.

Badacze zaobserwowali, że kofeina, zgodnie z oczekiwaniami, tworzy wiązanie pi pomiędzy RyR1-Trp4716 i RyR1-Ile4996 oraz oddziałuje z karbonylem szkieletu RyR1-Glu4239 poprzez mostek wodny (przez karbonyl C₆=O), ale nie angażuje RyR1-Tyr5014 (N1 jest metylowany). Mały rozmiar cząsteczek ksantyny i kofeiny, oprócz otoczki hydratacyjnej, prawdopodobnie utrudniał w przeszłości określenie koordynacji kofeiny, a teraz dzięki lepszej mocy obliczeniowej i rozdzielczości można być pewnym sposobu wiązania zarówno ksantyny, jak i kofeiny. Co więcej, zaangażowanie RyR2-Glu4194 i RyR1-Glu4239 sugeruje, że stabilizacja domeny kciuka i palca wskazującego (TaF) dodaje kolejną warstwę transdukcji sygnału. Co ciekawe, pozycja kofeiny jest odwrócona w porównaniu z ksantyną, co sugeruje elastyczne miejsce wiązania dostosowujące się do podstawień chemicznych.

Aby określić minimalny motyw niezbędny do wiązania w miejscu ksantyny/kofeiny i jak różne podstawienia wpływają na sposób koordynacji, rozwiązano strukturę cryo-EM RyR1 w obecności różnych pochodnych ksantyny. Zbadano następujące pochodne ksantyny z podstawnikami w różnych pozycjach: dostępne komercyjnie antagonisty receptora adenozynowego i inhibitory fosfodiesterazy pentoksyfilina, dyfilina, IBMX i enprofilina oraz naturalnie występujący nukleozyd ksantozyna. Używając ukierunkowanego przetwarzania cryo-EM, osiągnięto lokalne rozdzielczości w zakresie od 2,34 do 3,14 Å. Znaleziono wyraźną gęstość cryo-EM w miejscu ksantyny/kofeiny dla pentoksyfiliny, dyfiliny, IBMX i enprofiliny, podczas gdy nie znaleziono gęstości dla ksantozyny. Udało się zamodelować najbardziej prawdopodobną pozycję pochodnych ksantyny dzięki wyraźnym dodatkowym gęstościom z grup podstawnikowych i znaleziono rusztowanie ksantyny w podobnej orientacji we wszystkich czterech próbkach, ułożone na RyR1-Trp4716.

Czy aktywacja RyRs przekłada się na funkcjonalną odpowiedź?

Zaobserwowano, że reszta RyR1-Tyr5014 nie była zaangażowana, gdy N1 był metylowany lub podstawiony (IBMX i pentoksyfilina), ale była zaangażowana, gdy N1 był niemodyfikowany lub protonowany (enprofilina). W przypadku dyfiliny wydawałoby się, że RyR1-Tyr5014 jest zaangażowany, oddziałując z karbonylem C2=O, ale niższa rozdzielczość tego zestawu danych czyni to niejasnym. Ponieważ znaleziono cząsteczki RyR1 w stanie otwartym z RyR1-Tyr5014 w konformacji niezaangażowanej (pentoksyfilina), stwierdzono, że ta konformacyjna elastyczność RyR1-Tyr5014 nie jest konieczna do bramkowania, ale może przyczyniać się do siły interakcji z ksantynami poprzez zaangażowanie dodatkowego wiązania wodorowego. Dodatkowo, dla pentoksyfiliny zaobserwowano, że karbonyl C2=O oddziałuje z karbonylem szkieletu reszty RyR1-Glu4239 poprzez cząsteczkę wody, jak obserwowano wcześniej dla ksantyny i kofeiny. Z tej analizy wyciągnięto wniosek, że aromatyczność jest niezbędna do wiązania pi z RyR1-Trp4716, protonowany N1 (niemodyfikowany) jest niezbędny do zaangażowania RyR1-Tyr5014, a karbonyl C2=O lub C6=O jest niezbędny do oddziaływania z karbonylem szkieletu RyR1-Glu4239 poprzez cząsteczkę wody. Pierścień imidazolowy 5-członowy nie odgrywa ważnej roli poza zapewnieniem większej powierzchni do wiązania pi z RyR1-Trp4716, co sugeruje, że niemodyfikowany sześcioczłonowy pierścień ksantyny (2,4-dioksopirymidyna) mógłby być minimalnym motywem do wiązania.

Badacze zmierzyli zależne od Ca²⁺ wiązanie rianodyny za pomocą testu wiązania [³H]rianodyny, który szacuje procent kanałów przechodzących do stanu otwartego. Zaobserwowano, że 1 mM kofeiny, pentoksyfiliny, dyfiliny, oksypurinolu i oksopyricidu miało podobny wpływ na zależne od Ca²⁺ wiązanie rianodyny RyR1. Zaobserwowano znaczący wzrost aktywacji RyR1 przy 1 µM i 3 µM wolnego Ca²⁺ dla wszystkich związków w porównaniu z kontrolami (P < 0,05). Sugeruje to, że związki te są wzmacniaczami aktywności RyR1 poprzez zwiększenie wrażliwości na Ca²⁺, jak opisano dla kofeiny.

Przeprowadzono również eksperymenty ex vivo pomiaru siły skurczu na mięśniach prostownika palców długich (EDL) myszy. Zmierzono siłę skurczu przed i po 5-minutowej inkubacji z 5 mM kofeiny, pentoksyfiliny, dyfiliny i oksypurinolu. Stwierdzono, że inkubacja z tymi związkami znacząco zwiększyła siłę skurczu mięśni EDL po 5 minutach inkubacji (P < 0,05). Ta krótka inkubacja miała na celu zminimalizowanie aktywności poza celem, która mogłaby zakłócić wyniki (pentoksyfilina i dyfilina są inhibitorami fosfodiesterazy, a oksypurinol jest inhibitorem oksydazy ksantynowej). Co więcej, odwrotny eksperyment, 5-minutowe płukanie buforem Krebsa mięśni EDL preinkubowanych z kofeiną, doprowadziło do znacznego zmniejszenia siły skurczu, sugerując odwracalność. Jest to zgodne z faktem, że związki te wiążą się i zwiększają aktywność RyR1 w sposób bezpośredni i odwracalny, potwierdzając, że związki zmieniają funkcję mięśni zgodnie z hipotezą.

Jakie znaczenie kliniczne mają modulatory RyRs?

U zdrowych osób aktywność RyRs jest dokładnie regulowana, kontrolowana zarówno przez modyfikacje potranslacyjne, jak i poziomy ekspresji RyRs. Dysregulacja aktywności RyRs okazała się szkodliwa dla normalnego funkcjonowania komórek mięśniowych i zdrowia jednostek. Destabilizacja stanu zamkniętego RyR, spowodowana modyfikacjami potranslacyjnymi indukowanymi stresem lub mutacjami z nabyciem funkcji, prowadzi do przeciekających RyRs i skutkuje stanami chorobowymi, które mogą być śmiertelne. Downregulacja aktywności RyRs prowadzi do niedoboru wapnia i zaburzeń osłabienia mięśni. Downregulację aktywności RyRs stwierdzono w chorobach obejmujących mutacje z utratą funkcji (choroby związane z RyR1 i zespół niedoboru uwalniania wapnia RyR2) oraz zmniejszoną ekspresję RyRs (miopatie, sarkopenia, niewydolność serca, kardiomiopatie, osłabienie mięśni OIT i inne). Farmakologiczne zwiększenie aktywności RyRs jest potencjalnym podejściem terapeutycznym do leczenia tych zaburzeń.

Kofeina jest znana od dziesięcioleci jako związek zwiększający aktywność RyRs, ale sposób wiązania był trudny do określenia. Ostatnie postępy w sprzęcie i oprogramowaniu cryo-EM pozwoliły teraz rutynowo osiągać rozdzielczość 2-3 Å i pewnie określać sposób wiązania kofeiny do RyR1, ksantyny do RyR2 i innych pokrewnych związków do RyR1. Co ciekawe, konformacja miejsca ksantyny/kofeiny pozostała niezmieniona niezależnie od wiązania ligandu, izoformy RyR (RyR1 vs. RyR2 vs. RyR3) i stanu (przygotowany vs. otwarty), co dodatkowo potwierdza wysoką konserwację tego miejsca. Analizując sposoby wiązania pochodnych i analogów ksantyny, badacze postulują, że motyw 4-oksopirymidyny/2-piridonu jest wystarczający i niezbędny do wiązania z miejscem ksantyny/kofeiny w RyRs. Motyw 4-oksopirymidyny/2-piridonu angażuje Trp4716, Tyr5014 i Glu4239 w RyR1 oraz Trp4645, Tyr4944 i Glu4194 w RyR2. Interakcja z tymi resztami stabilizowałaby domeny CTD i TaF, umożliwiając lepszą transdukcję sygnału od wiązania Ca²⁺ do bramkowania poru. Proponowany motyw jest zgodny z niezdolnością adeniny i jej pochodnych do wiązania się z tym miejscem, ponieważ adenina N1 nie jest protonowana, będąc niezdolną do tworzenia wiązania wodorowego z RyR1-Tyr5014, i nie ma karbonylu, który mógłby działać jako silny akceptor wiązania wodorowego do oddziaływania z RyR1-Glu4239 poprzez mostek wodny. Co więcej, proponowany motyw 4-oksopirymidyny pozwolił racjonalnie znaleźć niepurynowy związek oksopyricid, który wiąże się z miejscem wiązania ksantyny/kofeiny i dodatkowo angażuje RyR1-Gln4246, prowadząc do bardziej stabilnego kompleksu i większej liczby otwartych cząsteczek.

Opracowanie pochodnych 4-oksopirymidyny/2-piridonu, które specyficznie wiążą się z miejscem ksantyny/kofeiny, może zostać wykorzystane do zwiększenia aktywności RyRs w chorobach związanych z mutacjami RyRs z utratą funkcji lub zmniejszoną ekspresją RyRs. RyRs są również ekspresjonowane w neuronach i limfocytach, co sugeruje, że modulacja RyRs może potencjalnie pomóc w leczeniu zaburzeń neurologicznych i immunologicznych. W przeciwieństwie do pochodnych i analogów ksantyny, opracowanie pochodnych 4-oksopirymidyny/2-piridonu zachowałoby właściwości aktywujące RyRs, jednocześnie zmniejszając wiązanie z innymi celami, takimi jak oksydoreduktaza ksantynowa, fosfodiesteraza i receptory adenozynowe. Zaletą pochodnych 4-oksopirymidyny/2-piridonu jest to, że poprzez wiązanie się z miejscem ksantyny/kofeiny zwiększają one wrażliwość RyRs na Ca²⁺, zachowując funkcjonalną i czasową aktywność normalnych RyRs. Inne aktywatory i agoniści niezależni od Ca²⁺ mogłyby przewlekle aktywować RyRs, zwiększając w ten sposób patologiczny wyciek Ca²⁺, który jest związany z chorobami RyR z nabyciem funkcji, takimi jak hipertermia złośliwa i katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy.

Przeprowadzono kilka badań klinicznych w celu oceny potencjału allopurinolu/oksypurinolu w leczeniu chorób serca. Podczas gdy metaanaliza wykazała znaczące kardioprotekcyjne efekty allopurinolu, inne badania nie wykazały poprawy lub poprawę tylko przy wyższych dawkach allopurinolu. Inna metaanaliza porównująca purynowe inhibitory oksydazy ksantynowej (allopurinol/oksypurinol) z niepurynowymi inhibitorami oksydazy ksantynowej (febuksostat/topiroxostat) wykazała, że tylko te pierwsze miały efekty kardioprotekcyjne, sugerując, że inhibicja oksydazy ksantynowej nie była wystarczająca i prawdopodobnie obecny był wtórny mechanizm. Główną słabością tych badań jest ustalony paradygmat, według którego inhibicja oksydazy ksantynowej, obniżenie kwasu moczowego i zapobieganie uszkodzeniom oksydacyjnym są odpowiedzialne za wszystkie kardioprotekcyjne efekty. Obecne badanie pokazuje, że allopurinol/oksypurinol wiąże się z miejscem ksantyny/kofeiny RyRs, sugerując, że allopurinol/oksypurinol może zwiększać aktywność RyRs i być korzystny w zaburzeniach z downregulacją RyRs. Paradygmat, że kardioprotekcyjny efekt allopurinolu/oksypurinolu wynika jedynie z inhibicji oksydazy ksantynowej, może wymagać rewizji, aby uwzględnić RyRs jako cele allopurinolu/oksypurinolu. Podobnie, ważne staje się rozważenie RyRs jako potencjalnych celów ubocznych pochodnych ksantyny (pentoksyfiliny, dyfiliny, IBMX i enprofiliny).

Podsumowanie

Receptory rianodynowe (RyRs) pełnią istotną funkcję w regulacji poziomu wapnia w komórkach mięśniowych i neuronach. Ich dysfunkcja, szczególnie w formie downregulacji, prowadzi do szeregu schorzeń, takich jak sarkopenia, niewydolność serca czy osłabienie mięśni na oddziałach intensywnej terapii. Badania strukturalne z wykorzystaniem cryo-EM ujawniły szczegółowy mechanizm wiązania ligandów do RyRs, w tym kofeiny i ksantyny, identyfikując motyw 4-oksopirymidyny jako kluczowy element wiążący. Modulatory RyRs, w tym allopurinol i oksypurinol, wykazują potencjał terapeutyczny w leczeniu chorób związanych z downregulacją RyRs, działając poprzez zwiększenie wrażliwości receptorów na wapń. Odkrycia te otwierają nowe możliwości w projektowaniu leków ukierunkowanych na RyRs, szczególnie w kontekście chorób mięśniowych i kardiologicznych.